Руны в Binding of Isaac: Afterbirth выполняют функции подбираемых предметов, которые действуют по тому же принципу, что и пилюли или карты, то бишь приносят вашему персонажу какой-то определенный эффект и занимая попутно один слот справа в низу экрана. Все руны разблокируются посредством прохождения определенных испытаний.
На фоне оригинальной игры в дополнении Binding of Isaac: Afterbirth появилось не так много новых рун. Первая - это Blank Rune (активирует эффект случайной руны, может еще выпасть еще одна пустая руны). Для ее разблокирования нужно пройти испытание № 30 (The Guardian).
Вторая же появилась в дополнении Afterbirth+, называется Black Rune (при эксплуатации превращает все собираемые предметы на полу в синих мух; поглощает предметы с пьедесталов и превращает их в случайные характеристики). Для открытия этой руны понадобится пройти Усложненный режим жадности Аполлионом.